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怎样建立一个PCR实验室?
发布人:admin 发布日期:2019-07-17

  怎样建立一个PCR实验室?

  为了对以个特定序列进行PCR做重复检测,需求三个不同的区域,每一个区域的详细技能操作和试剂不才面详细列出.

  1、样品准备区

  这个区域专门用作样品的准备,在制备和操作用于核酸提取的试剂时应该采取预防措施:

  1)PCR产品和带有要扩增序列的DNA克隆不能在这个房间操作。

  2)安排培育物、安排标本和血清样品都带进样品准备间处理,以依据运用的需求提取DNA或RNA。

  3)用于样品处理的东西不能被用作一般分子克隆的东西,也不能用作操作靶序列。

  4)DNA样品应该用有专门的防护或正压活塞式移液管操作,以防止在招致样品时有气溶胶留传。

  5)大体积样品应该用独自包装的无菌一次性移液管招致。

  6)管子翻开前都要简略离心以减少气溶胶的发生,并且管子不能用力崩开,这样会发气愤溶胶。

  7)任何时候都应该穿实验服和带手套,手套要常常替换,尤其在抽提进程中每一步之间都要替换。实验服要专门用于样品准备间,常常清洗。

  2、样品准备和RNA-PCR

  RNA-PCR的额外进程需求额外的样品操作,这样增加了样品之间污染的机会。为了防止这一问题,反转录一步可以在样品准备区进行。在RNA-PCR中运用UNG以防止污染的方法也有报导。

  3、前PCR区

  有必要有专门用于准备各种反应的区域,这个区域有必要坚持洁净,并且没有来自克隆和样品准备的污染。前PCR区有必要要有试剂和准备,特别是专门用于前PCR区的正压活塞式移液管。

  4、PCR实验室试剂的操作

  1)所用的全部溶液都应该没有核酸和(或)核酸酶(DNase和RNase)污染。

  2)全部PCR试剂中运用的水都应该是高质量的-新鲜蒸馏的去离子水,用0.22μm过滤的,并且是高压灭菌。

  3)在20℃到25℃储存的试剂建议加点像叠氮钠一类的抗微生物剂,在扩增试剂或样品制备试剂中参加0.025%的叠氮钠不抑制扩增反应。

  4)所用试剂都应该以大体积制造,实验一下看试剂是否满足,然后分装成仅够一次运用的量进行储存。

  5)全部试剂和样品准备进程中都要运用一次性灭菌的瓶子和管子。

  6)新制造的试剂在用于准备新的标本之前应该加以查验。

  7)样品准备和前PCR区所运用的移液管在不运用时都应该留心保存。

  5、在前PCR区树立PCR混合物

  1)可以把立刻可用的“主混合物”溶液配好、分装并保存在-20℃或4℃,在实验室只涉及到扩增一种或少数几种特异序列时这样做很有用。

  2)假设你的实验室运用多套引物,以致于制造包括全部试剂的单一反应混合物不行经济,可以考虑分装保存够一天的PCR成分。

  3)作为一个规则,应该保存一套阴性、弱阳性和强阳性对照样品来分析样品制造和PCR前进程的功率和洁净程度。并且,你也期望经过运用一个已知的弱阳性样品来验证你的样品缓冲液以证明里边不含扩增抑制物。

  4)阴性样品要与每组样品同时做,以分析是否存在样品与样品之间的污染以及是否存在PCR产品的污染,阴性对照应该包括核酸以外的全部试剂。

  5)作为阳性对照时,有两个理由选择了应该运用最少数量的核酸。

  6)由于有必要有对照反应,对照模板的特色应该予以考虑。

  6、控制污染的方法

  已规划出很有力的酶学方法用来消除一种方法的污染?运用UNG,这一技能能有效地消除由PCR产品引起的污染。另一种控制污染的方法是运用紫外线,这种方法不能彻底消除污染问题,但可以将污染下降几个数量级。

  7、PCR仪的方位

  8、后PCR区

  PCR结束今后,需求分析样品并阐明数据,应该留出一个专门用于反应后处理样品的当地。后PCR活动中运用的所用试剂、一次性耗材和仪器都有必要是专门用于这一目的,决不能把实验室这一区域的试剂或仪器用于任何前PCR活动。